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Wie lang sollten Primer sein?
Desweiteren sollten die Primer zwischen 20 und 30 Nukleotide lang sein und eine relativ hohe Hybridisierungstemperatur erlauben. In den Primern sollten, wenn möglich, alle vier Basen in etwa gleich häufig vorhanden sein.
Wie kann die Spezifität von Primern beeinflusst werden?
Reduzieren Sie die Primerkonzentration. Erhöhen Sie die Annealingtemperatur – achten Sie dabei darauf, die Schmelztemperatur der Primer nicht zu übersteigen. Verkürzen Sie die Annealing-Zeit – durch diese stringenteren Bedingungen werden die “echten” Primer begünstigt.
Wie lang ist ein RNA Primer?
Primer für PCR-Ansätze haben in der Regel eine Länge von 18–30 Nukleotiden. Diverse Biotechnologiefirmen bieten mittlerweile maßgeschneiderte Primer für molekularbiologische Anwendungen an.
Warum sollten Primer nicht zu kurz sein?
Auch die Primer-Konzentration ist ein wichtiger Faktor: Wird der Primer in zu geringer Konzentration eingesetzt, gibt es nur wenig oder gar kein Reaktionsprodukt, während es bei einer zu hohen Primer-Konzentration zu unspezifischer Primer-Bindung (Fehlpriming) und einer Akkumulation unspezifischer Produkte kommen kann.
Warum muss man DNA vervielfältigen?
Die PCR wird in biologischen und medizinischen Laboratorien eingesetzt, um grosse Mengen von definierten DNA-Abschnitten zu bekommen, die in weiteren Verfahren verwendet werden: Vaterschaftstests, der Nachweis bestimmter genetischer Erkrankungen oder Virusinfektionen, die Klonierung von Genen, ja sogar der Nachweis …
Warum werden die theoretisch möglichen Ausbeuten an PCR Produkten nicht erreicht?
Die Ausbeute einer PCR ist allerdings stark von der Qualität dieses DNA-Moleküls abhängig. Bei DNA-Proben aus fossilen Knochen oder von stark verwesten Leichen ist die DNA oft durch den Alterungsprozess oder die Lagerbedingungen beschädigt.
What is a primer dimer and why is it important?
The primer dimer is one of the most common problems in conventional PCR as well as in the real-time PCR. Even, dimerization is a curse for the DNA sequencing too. Once some of the complementary bases bind to the complementary bases of other primers, in some stringent condition, the primer dimers are formed.
How to detect the primer dimer in real-time PCR?
In the real-time PCR, the primer dimer can be detected using the melting curve analysis. Once the real-time PCR reaction is completed, the amplicons are melted to check the non-specific bindings. The melting temperature of the targeted DNA is higher than the melting temperature of the primer dimers.
Why do my primer dimers fail chromatograms?
Most primer dimers result in a failed chromatogram since their short sequencing products (from small 5′ overhangs) remain in the retentate. These can only be diagnosed using a primer design program such as the ones listed below.
What are homodimers and dimers?
Generally, homodimers (i.e., dimers involving the same strand) are rarely observed. Primer dimer artifacts typically occur at a large threshold cycle number (usually > 35 cycles), which is higher than the threshold cycle number for the desired amplicon.